?                                          生物醫藥行業(yè)的技術(shù)盛會(huì )

7月17-19日，由中國藥學(xué)會(huì )主辦的“第七屆中國藥學(xué)會(huì )生物技術(shù)藥物質(zhì)量分析研討會(huì )”盛大召開(kāi)，來(lái)自生物醫藥及科研領(lǐng)域的多位專(zhuān)家及現場(chǎng)近300位行業(yè)人士相聚夏日炎炎的北京，共同探討生物醫藥行業(yè)內的研究進(jìn)展及前沿技術(shù)。

賽默飛色譜質(zhì)譜生物制藥業(yè)務(wù)發(fā)展經(jīng)理唐愷帶來(lái)《基于高分辨質(zhì)譜平臺的宿主細胞殘留蛋白（HCPs）檢測》的解決方案，助力生物醫藥行業(yè)解決HCPs分析難題。

賽默飛色譜質(zhì)譜生物制藥業(yè)務(wù)發(fā)展經(jīng)理唐愷

什么是HCPs？為什么需要關(guān)注HCPs？

重組蛋白類(lèi)藥物是由遺傳修飾的原核或真核宿主細胞培養/發(fā)酵產(chǎn)生，由于細胞凋亡/死亡/裂解，其他非必需蛋白質(zhì)也可能釋放到細胞培養基/發(fā)酵液中，因此殘留在終產(chǎn)品中的其他蛋白質(zhì)即為宿主細胞殘留蛋白（HCPs）。

HCPs的存在會(huì )影響藥物的安全性和有效性，以及具有蛋白水解活性的HCPs影響藥物產(chǎn)品的穩定性，因此生物醫藥公司不斷優(yōu)化其純化工藝，從而控制終產(chǎn)品中HCPs的種類(lèi)和含量。

現有分析方法有哪些不足？

目前ELISA方法因其高靈敏度、高通量和易操作優(yōu)勢成為工業(yè)界的金標準，但仍存在很多限制。包括：

1.不能對HCPs進(jìn)行鑒定，低豐度HCPs的檢測易受限于高豐度蛋白的干擾；

2.定量動(dòng)態(tài)范圍（3個(gè)數量級）較低，抗體受限，開(kāi)發(fā)周期長(cháng)；

3.無(wú)法改變已有的方法，缺少校正標準限制定量的準確性，因此需多種檢測方法相結合。

高分辨質(zhì)譜技術(shù)的優(yōu)勢

隨著(zhù)高分辨質(zhì)譜技術(shù)性能的不斷提升，已具有高靈敏度和寬的定量動(dòng)態(tài)范圍，以及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，可實(shí)現對未知蛋白質(zhì)的高通量定性和定量。

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組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀

基于nanoLC-MS/MS高靈敏平臺的方法，如何對HCPs進(jìn)行準確定性和相對定量呢？

一、樣品前處理

2017年禮來(lái)制藥公司Huang, Lihua, et al.在A(yíng)nalytical Chemistry雜志上發(fā)表中的方法是，以NIST抗體標準品為例，在蛋白質(zhì)非變性的條件下進(jìn)行酶切，抗體主成分被部分酶切，酶切后經(jīng)90度高溫變性，未被酶切的部分將被沉淀去除，從而提高HCPs的鑒定幾率和方法的動(dòng)態(tài)范圍。

我們在此基礎上進(jìn)一步優(yōu)化，縮短前處理時(shí)間提高工作效率，同時(shí)為考察此套流程對1-100ppm的HCPs的鑒定和相對定量能力，加入內標蛋白UPS2（48種蛋白，6個(gè)不同濃度）進(jìn)行定性和相對定量。

圖1.樣品前處理流程示意圖（來(lái)自Huang, Lihua, et al.）

二、儀器、色譜柱、數據分析軟件

目前根據液相色譜的流速可分為納升液相色譜（nanoLC,<1µL/min）、毛細管液相色譜（capillaryLC,1-1µL/min）、微流速液相色譜（microLC,10-100µL/min）、分析流速液相色譜（LC,>100µL/min），由于樣品單位濃度和離子化效率依次下降，因此其靈敏度逐漸下降，本次實(shí)驗采用靈敏度zui高的納升液相系統。

三、實(shí)驗結果

1.定性結果：

內標蛋白UPS2中含有48種內標蛋白6個(gè)不同濃度，共鑒定其中24種，其實(shí)際含量結果如表1，含量范圍為0.05-444.88ppm，實(shí)際含量>1ng（10ppm）的16種內標蛋白全部鑒定到，實(shí)際含量在0.06-0.38ng（0.6-3.8ppm）范圍內共鑒定到6種，此方案的靈敏度足以滿(mǎn)足生物藥領(lǐng)域客戶(hù)的需求。

表1.本次實(shí)驗中鑒定到UPS2內標蛋白的種類(lèi)及其實(shí)際含量

2.蛋白相對定量結果：

本次實(shí)驗進(jìn)行HCPs的相對定量，采用蛋白TOP3的特異性肽段峰面積的平均值算法，得出每種蛋白的峰面積，經(jīng)過(guò)三次技術(shù)重復，對特異性肽段大于等于1的蛋白峰面積進(jìn)行統計，平均峰面積分布如圖3A，峰面積大于1e?的蛋白為此樣品的主抗體，可看出本實(shí)驗定量范圍達6個(gè)數量級。UPS2內標蛋白的峰面積與含量的分布如圖3B，峰面積與含量存在一定的線(xiàn)性關(guān)系， HCPs的相對含量可根據其峰面積進(jìn)行初步判斷，進(jìn)而優(yōu)化純化工藝。

圖3A.特異性肽段大于等于1的蛋白峰面積分布圖

圖3B.內標蛋白UPS2的峰面積（log2）與其含量的分布

基于UHPLC-MS/MS平臺的方法：

UHPLC-MS/MS對于低含量HCPs的檢測時(shí)，需提高上樣量（至少是納升液相系統的50倍）以提高其靈敏度。

經(jīng)實(shí)例驗證此方法同樣滿(mǎn)足當前大部分需求，某抗體藥物的HCPs經(jīng)ELISA定量為5ppm，UHPLC-MS/MS能夠準確鑒定到6種HCPs（unique peptides≥2）,通過(guò)內標UPS2確定其檢測限達1ppm，6種HCPs的相對含量在1-10ppm內。

小結

隨著(zhù)蛋白質(zhì)組學(xué)的飛速發(fā)展，賽默飛Orbitrap高分辨質(zhì)譜，可采用納升液相，超液相兩種方式，定性和相對定量分析HCPs，LOD均低至1ppm以下，為傳統的ELISA方法補充更為豐富的信息，進(jìn)一步幫助生物醫藥企業(yè)優(yōu)化純化工藝，監控終產(chǎn)品和過(guò)程產(chǎn)物中的HCPs含量。